近日，中国科学院合肥物质院健康所表观组学与智能解析团队，在《Nature Protocols》发表方法学论文，系统介绍了多重单细胞简化代表性亚硫酸氢盐测序（Msc-RRBS）技术，形成从单细胞分选、文库构建到数据分析的标准化方案，为高通量解析细胞间DNA甲基化差异提供技术支持。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在基因表达调控、基因组稳定性维持及细胞身份维系中发挥重要作用。其模式在胚胎发育、细胞分化过程中发生动态重塑，并在肿瘤等疾病的发生发展过程中常出现异常改变。准确描绘不同细胞的DNA甲基化特征，有助于理解细胞命运调控及疾病发生发展机制。

传统群体测序主要反映细胞群体的平均甲基化水平，容易掩盖细胞间的差异。单细胞测序能够突破这一局限，但仍面临DNA起始量极低、建库过程中易损失等技术挑战。如何减少DNA损失、提高样本处理通量并简化实验操作，是推动单细胞甲基化研究规模化开展的关键。

针对上述问题，研究团队在前期RRBS技术研究基础上，对反应体系、接头结构及样本处理方式进行优化，形成了兼顾通量、成本与数据质量的Msc-RRBS工作流程。该方法将细胞裂解、酶切、末端修复和接头连接整合于同一微孔，省去步骤间纯化，减少DNA损失；带有内嵌条形码的截短接头设计，使接头二聚体长度缩短至约60 bp，便于通过磁珠纯化有效去除，从而改善文库质量、提高测序效率。利用条形码实现24个单细胞样本在接头连接后合并处理，在保留单细胞分辨率的同时，减少试剂消耗与操作复杂度。

此外，论文提供了配套的自动化数据处理流程SingleCellMethPipe，整合数据拆分、预处理、序列比对、甲基化识别和质量控制等环节，并给出差异甲基化分析、功能注释及通路富集的方法，使实验获取的数据能够与下游生物学分析有效衔接。公开的分析代码和规范化流程，为研究人员复用该方法、开展可重复的单细胞甲基化分析提供了支持。

图1：Msc-RRBS文库构建和甲基化分析流程示意图

为展示方法性能，研究团队选取一名健康供者和一名骨髓增生异常综合征患者的骨髓样本，对其中的造血干细胞和造血祖细胞进行单细胞分析。在构建的96个单细胞文库中，86个通过预设质量控制标准，质控通过率为89.6%；平均亚硫酸氢盐转化率为99.84%，合格文库平均每个细胞覆盖约64万个CpG位点。进一步分析展示了该方法识别不同细胞类型及健康、疾病样本间甲基化差异的能力。

Msc-RRBS优先富集启动子、CpG岛等CpG密集区域，并覆盖部分其他调控元件，为研究基因调控相关的甲基化变化提供了经济实用的技术路径。本论文将实验步骤、质量控制及分析资源系统整合，有助于推动单细胞DNA甲基化技术的推广应用，为发育、造血和肿瘤等领域的细胞异质性与表观遗传调控研究提供支撑。

该论文的共同第一作者为中国科学技术大学博士研究生刘芳和黄健，通讯作者为健康所谷红仓研究员、健康所张帆研究员和中国医科大学附属第一医院血液科王晓雪教授。该研究工作获得国家科技重大专项、国家自然科学基金、中国科学院人才基金、安徽省自然科学基金、辽宁省自然科学基金等相关科研项目支持。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41596-026-01452-9